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（1）ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。如在电子显微镜下可观察到DNA聚合酶Ⅰ可结合到它合成的DNA模板上。用X射线晶体结构分析，研究了羧肽酶A和它的底物Gly-L-Tyr的相互作用及其作用位置（见第10章）。

（2）许多酶和底物的光谱特性在形成 ES 复合物后发生变化。例如色氨酸合成酶为一组菌酶，含有一个磷酸吡哆醛辅基，该酶催化 L-Ser 和吲哚合成 Trp，加 L-Ser 到酶中磷酸吡哆醛的荧光显著增加，随后加吲哚使荧光猝灭到低于单独酶的水平（图 9-7），因此荧光光谱揭示了酶-Ser 和酶-Ser-吲哚复合物的存在。其他光谱学方法，如核磁和顺磁共振，因二色谱也能对 ES 的形成提供信息。

(3) 酶的物理性质，如溶解度或热稳定性，经常在形成 ES 复合物后发生变化。

（4）已分离得到某些酶与底物相互作用生成的ES复合物，如已得到乙酰化胰凝乳蛋白酶及D-氨基酸氧化酶和底物复合物的结晶。

(5) 超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降现象。平衡透析时观察到底物浓度在半透膜内外不同等。

（二）酶促反应的动力学方程式

1. 米氏方程式的推导

1913年 Michaelis 和 Menten 在前人工作的基础上，根据酶反应的中间复合物学说：

\ce{E + S <=>[$k_5$] ES ->[$k$] E + P} \tag{9-10}

假定 $E + S \rightleftharpoons ES$ 迅速建立平衡，底物浓度远远大于酶浓度下，ES 分解成产物的逆反应忽略不计，以“快速平衡法”，推导出一个数学方程式，表示了底物浓度与酶反应速率之间的定量关系，通常称为米氏方程。

$$\begin{array}{cccc}& v=\frac{V_{\max }\cdot [S]}{K_s+[S]}& & \text{(9-11)}\end{array}v=\backslash frac\{V\_\{\backslash max\}\backslash cdot[S]\}\{K\_\{s\}+[S]\}\backslash tag\{9-11\}$$

式中 $v$ 为反应速率，$V_{\max}$ 为酶完全被底物饱和时的最大反应速率，$[S]$ 为底物浓度，$K_s$ 为 ES 的解离常数（底物常数）。

1925 年 Briggs 和 Haldane 提出了稳态(steady state)理论,对米氏方程做了一项很重要的修正,酶促反应分两步进行:

第一步:酶与底物作用,形成酶-底物复合物:

$$\begin{array}{cccc}& E+SES& & \text{(9-12)}\end{array}E\; +\; S\; \backslash underset\{k\_\{2\}\}\{\backslash overset\{k\_\{1\}\}\{\backslash rightleftharpoons\}\}\; ES\; \backslash tag\{9-12\}$$

第二步:ES复合物分解形成产物,释放出游离酶;

$$\begin{array}{cccc}& \mathrm{F}\mathrm{S}\mathrm{P}+\mathrm{E}& & \text{(9 - 13)}\end{array}\backslash mathrm\{FS\}\; \backslash underset\{k\_\{4\}\}\{\backslash overset\{k\_\{3\}\}\{\backslash rightleftharpoons\}\}\; \backslash mathrm\{P\}+\backslash mathrm\{E\}\backslash tag\{9\; -\; 13\}$$

这两步反应都是可逆的。它们的正反应与逆反应的速率常数分别为 $k_1, k_2, k_3, k_4$。

由于酶促反应的速率与ES的形成与分解直接相关,所以必须考虑ES的形成速率和分解速率。Briggs和Haldane的发展就在于指出ES量不仅与式(9-12)平衡有关,而且还与式(9-13)平衡有关,用稳态代替了平衡态。

所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统的复合物ES浓度，由零逐渐增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和产物浓度不断地变化，复合物ES也在不断地生成和分解，但是当反应系统中ES的生成速率和ES的分解速率相等时，络合物ES浓度保持不变的这种反应状态称为稳态，即：

$$\frac{d[ES]}{dt}=0\backslash frac\{d[ES]\}\{dt\}=0$$

图 9—8 表示实验所得各种浓度对时间的曲线，表示了底物浓度降低，产物形成及 ES 稳态过程。